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報告基因應用之轉錄后調控
發布日期:2019/06/04
點擊量:723

1.我們可以提供的產品:

A.載體:

C8011:psiCHECK-1

C8021:  psiCHECK-2

E1330:pmirGLO DUAL-Luciferase miRNA target vector

B. 體外轉錄試劑盒

P1700:T7 RiboMAX Express RNAi system

C.轉染試劑:E2311

D.檢測試劑:E1910,E2920

E.檢測用白板:6005290(純白板),655098(底透白板)

2.載體選擇

a.psiCHECK1

psiCHECK2

 

 

 

 

 

 

 

 

 

psiCHECK™ -1 和psiCHECK™ -2 載體用于對RNA干擾(RNAi)的早期優化提供快速的定量方法。此載體可監測與報告基因融合的目的基因表達的變化。兩種載體都應用海腎螢光素酶作為主要報告基因,目的基因被克隆至海腎螢光素酶翻譯終止密碼子下游的多克隆位點。由合成的siRNA 或體內表達的shRNA 引發的針對目的基因的RNAi過程,導致融合mRNA 的剪切和隨后的降解。推薦C8011用于檢測活細胞中的RNAi效果,使用活細胞底物E6481檢測酶活性變化,可以持續檢測。C8021含有兩個報告基因,用于終點裂解檢測。

 

c. E1330:pmirGLO DUAL-Luciferase miRNA target vector. pmirGLO Vector 被設計用于定量評估miRNA 的活性,這是通過將miRNA 的靶序列插入到螢火蟲螢光素酶基因(luc2)的下游或者3` 端實現的。螢火蟲螢光素酶作為主要報告基因,其表達減少意味著內源性的或外源引入的miRNA 與克隆的miRNA 的靶序列發生了結合。這一載體是基于Promega 的雙報告基因技術,螢火蟲螢光素酶基因(luc2 ) 作為主報告基因,用于監控mRNA 的調節,海腎螢光素酶基因(hRluc-neo ) 作為對照報告基因,用于進行歸一化處理和陽性篩選。

3.實驗流程

a.拿到選好的實驗載體后普通轉化,做菌種保存,中量提取,為后續實驗準備好載體。

b.分子克隆實驗:將靶標UTR克隆入選好的載體,轉化提取鑒定正確后,中量提取,準備轉染實驗。

c. 設置好實驗對照,將中量提取好的實驗質粒用轉染試劑E2311轉染到細胞中,轉染后24小時將目的siRNA或者miRNA轉染到細胞中,24小時后可以開始進行檢測。

d.檢測流程:如果選用閃光型試劑E1910,E1960,需要去除培養基,洗滌細胞,加入裂解液,至細胞充分裂解,取20ul裂解產物 進行檢測,適合樣品數量比較少的客戶。如果采用輝光型試劑E2920,E2940,只需將檢測試劑加入代檢孔,等待30分鐘即可開始檢測,操作比較簡單,適合做高通量的客戶。

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