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報告基因應用之啟動子研究
發布日期:2019/06/04
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1.我們可以提供的產品種類:

 

1.載體選擇:

a.第一代實驗載體現在已經基本停用了,這代載體攜帶的Promega第一代luciferase基因,該載體幾乎未經基因工程改造,載體上的luciferase基因在實驗的過程中有很多本底應答,造成背景比較高,現在比較通用的luciferase基因是簡寫為luc2的基因,去除了很多本底應答。

b.第二代實驗載體推出后得到了廣泛的應用,現在還有很多人在使用,是目前擁有文獻最多的載體。這代載體在選擇內參載體時依然選用第一代,首選是pRL-TK的質粒,這個質粒所攜帶的啟動子是這三個內參載體中最弱的一個,內參信號較之另外兩個更弱一點,更利于實驗結果的比較。

c.第三代載體是最先進的載體,在這里我們可以選擇是螢火蟲做實驗載體還是海腎的做實驗載體,與之對應的內參載體也有兩種可以選擇,同時我們第三代載體做了兩種,一種不帶篩選標價,另一種帶篩選標記。帶篩選標記的質粒可以做成穩轉細胞株,以方便實驗進行,不用反復轉染細胞。

2.實驗流程:

a.拿到購買的質粒后,普通轉化實驗,做一個菌種保藏,方便以后永久使用購買的載體。將載體復制后即可開始后續實驗。

b.載體構建:進行分子克隆,將待研究啟動子構建入選好的實驗載體,鑒定正確,質粒中量提取,為轉染做準備。

c.細胞實驗:設置好實驗對照,將中量提取好的實驗質粒和對照質粒分別與內參質粒按照合適比例(2:1——50:1)用轉染試劑E2311共同轉染到細胞中,轉染后24小時可以開始進行檢測。

d.檢測流程:如果選用閃光型試劑E1910,E1960,需要去除培養基,洗滌細胞,加入裂解液,至細胞充分裂解,取20ul裂解產物 進行檢測,適合樣品數量比較少的客戶。如果采用輝光型試劑E2920,E2940,只需將檢測試劑加入代檢孔,等待30分鐘即可開始檢測,操作比較簡單,適合做高通量的客戶。

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